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Milchsäurebakterien spielen in der Brauerei eine besondere Rolle, sie haben sowohl als Nützlinge wie auch als Schädlinge Bedeutung erlangt. Eine positive Rolle spielen sie, wenn sie gezielt eingesetzt werden, um das Endprodukt zu optimieren. Weitaus mehr Bedeutung kommt ihnen allerdings als Schadorganismen zu, denn sie gehören zu den häufigsten Bierverderbern. Dr. Jennifer Schneiderbanger von Lehrstuhl für Brau- und Getränketechnologie, TU München, wirft einen Blick auf die zwei gegensätzlichen Gesichter der Milchsäurebakterien.

Milchsäurebakterien sind grampositive, kokkoide oder stäbchenförmige, nicht-sporulierende, Katalase-negative, aero- und säuretolerante Mikroorganismen. Sie haben komplexe Nährstoffansprüche und produzieren Milchsäure als Hauptprodukt ihres Metabolismus, was ihnen auch zu ihrem Namen verhalf [1]. Sie werden je nach Stoffwechselweg und den daraus entstehenden katabolischen Endprodukten der Kohlenhydratverwertung in homofermentative (Embden-Meyerhof-Parnas-Weg), heterofermentative (Phosphoketolase-Weg) und fakultativ heterofermentative (je nach Substrat unterschiedlich) Milchsäurebakterien eingeteilt [2, 3]. Aufgrund ihrer typischen Assoziation mit Lebensmittelfermentationen haben Milchsäurebakterien den GRAS-Status (generally regarded as safe) inne [3]. An dieser Stelle ist wichtig zu bemerken, dass die Familien Lactobacillaceae und Leuconostocaceae durch Zheng et al. auf Basis ihrer „whole genome sequences“ in 23 neue Gattungen eingeordnet wurden. Der Klarheit halber wird in diesem Artikel noch die bekannte Nomenklatur verwendet, jedoch an manchen Stellen auf die neue Taxonomie verwiesen.

 

Milchsäurebakterien als Nützlinge

Die biologische Säuerung wird in manchen Brauereien auch heute noch entweder in Form einer Würze- oder einer Maischesäuerung eingesetzt. Grundlage dieser Technik ist die Zugabe von durch verschiedene Spezies der Gattung Lactobacillus (L.) vergorener Würze, um verschiedene Vorteile während der Bierproduktion zu erreichen. Durch die einhergehende Reduktion des pH-Werts der Würze oder der Maische erreichen amylolytische, proteolytische und glucanolytische Enzyme ihr pH-Optimum, was in einer verbesserten Verarbeitbarkeit und letztendlich in einer besseren Bierqualität resultiert [5]. Des Weiteren konnte ein runderes Aromaprofil, eine angenehmere Bittere sowie eine geringere Gefahr zur Proteintrübung aufgrund vollständigerer Proteinfällung festgestellt werden [6, 7]. Weitere Vorteile, die durch biologische Säuerung erzielt werden können, sind bessere Diacetylreduktion, hellere Bierfarbe, erhöhter Tannoidgehalt sowie verbesserte Geschmacksstabilität [8]. Für die biologische Säuerung eingesetzte Kulturstämme sollten kein Bierschädigungspotential aufweisen, moderat thermophil sein, in ungehopfter Würze anwachsen und diese ansäuern können, vornehmlich homofermentativ sein, kein Diacetyl und keine biogenen Amine produzieren und Bestandteil der natürlicherweise auf den eingesetzten Rohstoffen vorkommenden Mikroorganismenflora sein (s. Tab. 1).

 Tabellarische Übersicht über zur biologischen Milchsäuerung eingesetzter MilchsäurebakterienTab. 1  Für die biologische Säuerung eingesetzte Milchsäurebakterien [3, 5, 8-13]

 

Die guten Säuerungseigenschaften der Milchsäurebakterien nutzen auch einige Brauereien zur Herstellung von Spezialbieren wie den belgischen Lambic-Bieren, Berliner Weisse oder Sauerbieren [14, 15]. Eine weitere positive Eigenschaft, die im Fokus zahlreicher Studien steht, ist die Fähigkeit von Milchsäurebakterien, niedermolekulare, hitzestabile Toxine (Bacteriocine oder Mycotoxine) zu produzieren, die das Wachstum von Bierverderbern behindern, während die Kulturhefe nicht beeinflusst wird [4, 16, 17]. Beispiele für solche Milchsäurebakterien sind L. plantarum, L. sanfranciscensis (früher: L. sanfrancisco, heute: Fructolactobacillus sanfranciensis) und Lactococcus lactis [4, 17–22].

 

Milchsäurebakterien als Schädlinge

Obwohl Bier aufgrund verschiedener intrinsischer und extrinsischer Hürden kein ideales Medium für das Wachstum von Mikroorganismen darstellt, können manche diesen widrigen Bedingungen trotzen und in Bier wachsen [23, 24]. Die intrinsischen biereigenen Hürden und deren Auswirkung auf Mikroorganismen zeigt Tabelle 2 [25]. Als Konsequenz aus Wachstum und Metabolismus bierschädlicher Mikroorganismen in Bier kann es zu Veränderungen in Geschmack, Geruch, Aussehen und Textur kommen [26]. Neben Wild- bzw. Fremdhefen und Vertretern der anaeroben Gattungen Pectinatus und Megasphaera stellen Milchsäurebakterien mit Abstand die größte Fraktion der bierschädlichen Mikroorganismen. Aber auch innerhalb dieser Fraktion sind nicht alle Spezies (noch nicht einmal alle Stämme innerhalb einer Spezies) zum Bierverderb in der Lage. Die eingebrachten Hopfensäuren in Kombination mit dem niedrigen pH-Wert des Mediums Bier gelten als Hauptkriterien für die mikrobielle Stabilität gegenüber den grampositiven Bierschädlingen der Gattungen Lactobacillus und Pediococcus (P.) [27].

 

Tabellarische Übersicht über Selbstschutzfaktoren im Bier
Tab. 2  Intrinsische Hürden des Bieres für mikrobielles Wachstum und Art der Wachstums-Beeinflussung [25]

 

Dabei kommt in der Brauereimikrobiologie nach wie vor die Einteilung nach Back in fünf Klassen der Bierschädlichkeit zum Tragen, von denen Vertreter der Klassen 1 (obligat bierschädlich) und 2 (potentiell bierschädlich) eine direkte Schädigung im Produkt verursachen können [11].

 

Die aktuelle Verderbsflora

Die Gruppe der bierschädlichen Bakterien ist nicht starr, sondern einem permanenten Wandel unterworfen, indem erstens neue Isolate innerhalb bisher als nicht-bierschädlich charakterisierter Spezies mit bierschädigendem Potential entdeckt werden (z. B. L. acetotolerans, L. rossiae), zweitens neue Spezies mit bierschädlichem Charakter beschrieben werden (z. B. L. backii, L. cerevisiae, L. curtus) und drittens andere wiederum von der Liste der bierschädlichen Bakterien aufgrund von Umbenennungen oder neuerer wissenschaftlicher Erkenntnisse gestrichen werden (z. B. L. brevisimilis, L. frigidus) [28]. An dieser Stelle muss ebenfalls angemerkt werden, dass das Merkmal „Bierschädlichkeit“ oft stammspezifisch (wie z. B. innerhalb der Spezies L. brevis) und seltener speziesspezifisch (wie z. B. innerhalb der Spezies L. backii) ist [29]. Einen Überblick über die aktuell als obligat oder potentiell bierschädlich geltenden Bakterien der Gattungen Lactobacillus und Pediococcus (inklusive der neuen Nomenklatur nach Zheng et al.) gibt Tabelle 3.

 

Tabellarische Übersicht über die bierschädlichen Milchsäurebakterien und ihr Schädigungspotential
Tab. 3 Überblick über die bierschädlichen Spezies (alte und neue Nomenklatur) sowie ihr Bierschädigungspotential [3, 28, 30–32]

 

Die Suche nach spezifischen Markergenen

Neben kulturellen Methoden war bisher Stand der Technik, zeitaufwändige Bierinokulationstests durchzuführen oder Kontaminanten mittels der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) auf Speziesebene zu identifizieren. Wie bereits erwähnt, erlaubt die reine Artidentifizierung aber selten einen konkreten Rückschluss auf das Bierschädigungspotential eines Isolats, da viele Spezies bierschädliche und nicht-bierschädliche Stämme beinhalten. Mit diesem Wissen im Hintergrund beziehen sich neuere Studien auf die Detektion speziesunabhängiger Markergene, deren Anwesenheit im Genom eines Isolats schnell und zuverlässig auf dessen Bierschädlichkeit schließen lassen. Aus diesen Studien wurde bereits deutlich, dass das Bierschädigungspotential meist nicht auf ein einziges Gen zurückzuführen, sondern multifaktoriell zu bewerten ist, also als Ergebnis einer Kombination verschiedener Faktoren [26, 29, 33–39].

 

Bakterien tauschen Gene speziesübergreifend aus

Gene, die für die Toleranz gegenüber den biereigenen Hürden kodieren, sind meist auf mobilen genetischen Elementen wie Plasmiden lokalisiert, die durch horizontalen Gentransfer zwischen Mikroorganismen (auch zwischen verschiedenen Spezies) ausgetauscht werden können [40, 41]. Einige der Gene gelten speziesübergreifend als Indikatoren für ein erhöhtes Bierschädigungspotential, andere wiederum wurden bisher nur innerhalb einer einzigen Spezies als Indikatoren identifiziert. Abbildung 1 zeigt, welche Markergene gegen verschiedene Stressoren, die durch das Medium Bier auf mikrobielle Kontaminanten ausgeübt werden, wirken.

 

Darstellung von Resistenzgenen und den Stressoren im Bier, denen sie entgegenwirken
Abb. 1 Mit dem Bierschädigungspotential assoziierte Gene (hellblau) und die Stressoren, denen sie entgegenwirken (dunkelblau)

 

Die parallele Detektion von horA und horC ist die bisher erfolgreichste Strategie, speziesübergreifend eine Aussage über die Bierschädlichkeit eines Isolats zu treffen. Es ist dennoch möglich, dass die beiden Markergene in manchen bierschädlichen Isolaten (insbesondere Pediococcus-Stämmen) fehlen oder in manchen nicht-bierschädlichen Isolaten detektiert werden können [29, 42, 43]. Bislang fehlt die Identifizierung des einen Gens bzw. der Kombination aus einigen wenigen Genen, sodass alle Mikroorganismen mit bierschädlichem Potential zu 100 Prozent nachgewiesen werden können.

 

Die Suche nach unbekannten Bierschädlingen geht weiter

In der Brauwirtschaft spielen Milchsäurebakterien demnach eine bedeutende Rolle, die je nach Einsatz (gezielt/ungezielt) und Stamm (bierschädlich/nicht-bierschädlich) stark variiert. Die mögliche Aufnahme Plasmid-lokalisierter DNA und damit potentieller Resistenzeigenschaften über horizontalen Gentransfer, wenn verschiedene schädliche und nicht-schädliche Milchsäurebakterien in einer Brauerei vorkommen, muss aus mikrobiologischer Sicht als kritisch betrachtet werden. Auf diese Weise konnten sich mutmaßlich zahlreiche Spezies über eine genügend große Zeitspanne an das unwirtliche Nischenmilieu in einer Brauerei anpassen. Die Suche nach weiteren, bisher unbekannten Genen innerhalb des Genoms von Milchsäurebakterien, die eine Toleranz gegenüber den biereigenen Hürden vermitteln, scheint zielführend, um die Bierqualität aus mikrobiologischer Sicht langfristig zuverlässig zu sichern.

 

Dieser Beitrag beruht auf dem in BRAUWELT Nr. 17/2021 veröffentlichten Artikel von Dr. Jennifer Schneiderbanger.

 

Literatur

1. Axelsson, L.: „Lactic acid bacteria: classification and physiology“, in Lactic Acid Bacteria: Microbiology and Functional Aspects von S. Salminen und A. von Wright, Marcel Dekker Inc., New York., 1998.
2. Kandler, O.: „Carbohydrate metabolism in lactic acid bacteria“, Antonie van Leeuwenhoek Journal of Microbiology, 49 (3), 1983, S. 209–224.
3. Zheng, J.; Wittouck, S; Salvetti, E.; Franz, C. M. A. P.; Harris, H. M. B.; Mattarelli, P.; O‘Toole, P. W.; Pot, B.; Vandamme, P.; Walter, J.; Watanabe, K.; Wuyts, S.; Felis, G. E.; Gänzle, M. G.; Lebeer, S.: „A taxonomic note on the genus Lactobacillus: Description of 23 novel genera, emended description of the genus Lactobacillus Beijerinck 1901, and union of Lactobacillaceae and Leuconostocaceae“, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 70 (4), 2020, S. 2782–2858.
4. Vaughan, A.; O’Sullivan T.; van Sinderen, D.: „Enhancing the microbiological stability of malt and beer – A review“, Journal of the Institute of Brewing, 111 (4), 2005, S. 355–371.
5. Lowe, D. P.; Ulmer, H. M.; van Sinderen, D.; Arendt, E. K.: „Application of biological acidification to improve the quality and processability of wort produced from 50% raw barley“, Journal of the Institute of Brewing, 110 (2), 2004, S. 133–140.
6. Pittner, H.; Back, W.: „Continuous production of acidified wort for alcohol free beer using immobilised lactic acid bacteria“, MBAA Technical Quarterly, 32, 1995, S. 163–168.
7. Back, W.; Pittner, H.: „Kontinuierliche Herstellung gesäuerter Würze mit Hilfe immobilisierter Milchsäurebakterien“, Monatsschrift für Brauwissenschaft, 46, 1993, S. 364–371.
8. Daumen, O. B., Bach, W.; Seidenschwan, A.; Schedhelm, R.: „Biological acidification in the brewing process, Part 3: Industrial scale tests, their effects and evaluation“, BRAUWELT International, I, 1989, S. 44–50.
9. Back, W.: „Biologische Säuerung“, Monatsschrift für Brauwissenschaft, 4, 1988, S. 152–156.
10. Bohak, I.; Back, W.; Richter, L.; Ehrmann, M.; Ludwig, W.; Schleifer, K. H.: „Lactobacillus amylolyticus sp. nov., isolated from beer malt and beer wort“, Systematic and Applied Microbiology, 21 (3), 1998, S. 360–364.
11. Back, W.: Farbatlas und Handbuch der Getränkebiologie, Band 1; Hans Carl Verlag, Nürnberg, 1994.
12. Nummer, B. A.: „Brewing with lactic acid bacteria“, Brewing Techniques, 4, 1996, S. 56–63.
13. Bokulich, N. A.; Bamforth, C. W.: „The microbiology of malting and brewing“, Microbiology and Molecular Biology Reviews, 77 (2), 2013, S. 157–172.
14. Spedding, G.; Aiken, T.: „Sensory analysis as a tool for beer quality assessment with an emphasis on its use for microbial control in the brewery“, in Brewing Microbiology – Managing Microbes, Ensuring Quality and Valorising Waste, A. E. Hill, Woodhead Publishing, Heidelberg, 2015.
15. Bergsveinson, J.; Ziola, B.: „Investigation of beer spoilage lactic acid bacteria using omic approaches“, in Brewing Microbiology – Current research, omics and microbial ecology, Bokulich, N. A.; Bamforth, C. W., Caister Academic Press: Norfolk, UK, 2017, S. 245–274.
16. Idler, F.; Annemüller, G.: „Bacteriocinbildende Milchsäurebakterien bei der Bierherstellung“, BRAUWELT Nr. 30/31, 2001, S. 1161–1168.
17. Ogden, K.; Waites, M. J.; Hammond, J. R. M.: „Nisin and brewing“, Journal of the Institute of Brewing, 94 (4), 1988, S. 233–238.
18. Haikara, A.; Uljas, H.; Suurnäkki, H.: „Lactic starter cultures in malting – a novel solution to gushing problems“, in Proceedings of the European Brewing Convention Congress, Oslo, 1993.
19. Corsetti, A.; Gobbetti, M.; Rossi, J.; Damiani, P.: „Antimould activity of sourdough lactic acid bacteria: identification of a mixture of organic acids produced by Lactobacillus sanfrancisco CB1“, Applied Microbiology and Biotechnology, 50 (2), 1998, S. 253–256.
20. Ogden, K., Nisin – a bacteriocin with a potential use in brewing, Journal of the Institute of Brewing, 92 (4), 1986, S. 379–383.
21. Müller-Auffermann, K.; Grijalva, F.; Jacob, F.; Hutzler, M.: „Nisin and its usage in breweries: a review and discussion“, Journal of the Institute of Brewing, 121 (3), 2015, S. 309–319.
22. Müller-Auffermann, K.; Grijalva, F.; Jacob, F.; Hutzler, M.: „Nisin-producing microorganisms and their implementation in brewers‘ wort“, Journal of the Institute of Brewing, 121 (3), 2015, S. 320–331.
23. Leistner, L.: „Basic aspects of food preservation by hurdle technology“, International Journal of Food Microbiology, 55 (1-3), 2000, S. 181–186.
24. Vriesekoop, F.; Krahl, M.; Hucker, B.; Menz, G.: „125th anniversary review: Bacteria in brewing: The good, the bad and the ugly“, Journal of the Institute of Brewing, 118 (4), 2012, S. 335–345.
25. Schneiderbanger, J.: „Auf die Gene kommt es an – die Ursache(n) der Bierschädlichkeit“, Der Weihenstephaner, Nr. 1, 2021, S. 26–30; Beitrag abrufbar auf www.vew-brauer.de.
26. Suzuki, K.: „125th Anniversary Review: Microbiological Instability of Beer Caused by Spoilage Bacteria“, Journal of the Institute of Brewing, 117 (2), 2011, S. 131–155.
27. Fernandez, J. L.; Simpson, W. J.: „Measurement and prediction of the susceptibility of lager beer to spoilage by lactic acid bacteria“, Journal of Applied Microbiology, 78 (4), 1995, S. 419–425.
28. Schneiderbanger, J.: „Occurrence, detection, characterization and description of selected beer-spoilage lactic acid bacteria“, PhD thesis, Wissenschaftszentrum Weihenstephan für Ernährung, Landnutzung und Umwelt, 2019, Technische Universität München, Freising.
29. Geißler, A.: „Lifestyle of beer spoiling lactic acid bacteria“, PhD thesis, Wissenschaftszentrum Weihenstephan für Ernährung, Landnutzung und Umwelt, 2016, Technische Universität München, Freising.
30. Hutzler, M.; Koob, J.; Riedl, R.; Jacob, F.: „Classification, Identification and Detection of Beer Spoiling Microorganisms – A Review“, World Brewing Congress, Portland/Oregon, 2012.
31. Hutzler, M.; Müller-Auffermann, K.; Koob, J.; Riedl, R.; Jacob, F.: „Bierschädliche Bakterien – Eine aktuelle Übersicht“, BRAUWELT Nr. 3, 2013, S. 58–60.
32. Schneiderbanger, J.; Jacob, F.; Hutzler, M.: „Mini-Review: The current role of lactic acid bacteria in beer spoilage“, BrewingScience, 73, 2020, S. 1–5.
33. Behr, J.: „Mechanisms of hop inhibition, tolerance and adaptation in Lactobacillus brevis“, PhD thesis, Wissenschaftszentrum Weihenstephan für Ernährung, Landnutzung und Umwelt, 2008, Technische Universität München, Freising.
34. Behr, J.; Geissler, A. J.; Schmid, J.; Zehe, A.; Vogel, R. F.: „The identification of novel diagnostic marker genes for the detection of beer spoiling Pediococcus damnosus strains using the BlAst Diagnostic Gene findEr“, Plos One, 22 (3), 2016.
35. Hayashi, N.; Ito, M.; Horiike, S.; Taguchi, H.: „Molecular cloning of a putative divalent-cation transporter gene as a new genetic marker for the identification of Lactobacillus brevis strains capable of growing in beer“, Applied Microbiology and Biotechnology, 55 (5), 2001, S. 596–603.
36. Haakensen, M.: „Genetic markers for beer-spoilage by lactobacilli and pediococci in Pathology and Laboratory Medicine“, PhD thesis, 2009, University of Saskatchewan, Saskatoon.
37. Feyereisen, M.; Mahony, J.; O‘Sullivan, T.; Boer, V.; van Sinderen, D.: „A Plasmid-Encoded Putative Glycosyltransferase Is Involved in Hop Tolerance and Beer Spoilage in Lactobacillus brevis“, Applied and Environmental Microbiology, 86 (3), 2020.
38. Bergsveinson, J.; Goerzen, S.; Redekop, A.; Zoerb, S.; Ziola, B.: „Genetic Variability in the Hop-Tolerance horC Gene of Beer-Spoiling Lactic Acid Bacteria“, Journal of the American Society of Brewing Chemists, 74 (3), 2016, S. 173–182.
39. Vogel, R. F.; Preissler, P.; Behr, J.: „Towards an understanding of hop tolerance in beer spoiling Lactobacillus brevis“, BrewingScience, 63, 2010, S. 23–30.
40. Haakensen, M. C.; Butt, L.; Chaban, B.; Deneer, H.; Ziola, B.; Dowgiert, T.: „HorA-specific real-time PCR for detection of beer-spoilage lactic acid bacteria“, Journal of the American Society of Brewing Chemists, 65 (3), 2007, S. 157–165.
41. Suzuki, K.: „Gram-positive spoilage bacteria in brewing“, in Brewing Microbiology – Managing Microbes, Ensuring Quality and Valorising Waste, A. E. Hill, Woodhead Publishing, Heidelberg, 2015.
42. Haakensen, M.; Pittet, V.; Morrow, K.; Schubert, A.; Ferguson, J.; Ziola, B.: „Ability of novel ATP-binding cassette multidrug resistance genes to predict growth of Pediococcus isolates in beer“, Journal of the American Society of Brewing Chemists, 67 (3), 2009, S. 170–176.
43. Haakensen, M.; Schubert, A.; Ziola, B.: „Multiplex PCR for putative Lactobacillus and Pediococcus beer-spoilage genes and ability of gene presence to predict growth in beer“, Journal of the American Society of Brewing Chemists, 66 (2), 2008, S. 63–70.